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T1 - Funktionelle Analyse von MLO Genen im Rosengenom

AU - Geike, Juliane

N1 - Dissertation

PY - 2018

Y1 - 2018

N2 - Die Rose ist eine der beliebtesten und die ökonomisch bedeutendste Zierpflanze weltweit. Die Produktion von Schnittrosen im Gewächshaus begünstigt die Infektion mit dem Erregr des Echten Mehltaus Podosphaera pannosa (Wallr.: Fr.) de Bary, welche nur durch den wiederholten Einsatz von Fungiziden effektiv bekämpft werden kann. Aufgrund der komplexen Genetik der Rose und der starken Rassenbildung des Pathogens ist die Etablierung von monogenen oder polygenen Resistenzen in Sorten besonders aufwendig und in der Regel nur von begrenzter Wirksamkeit. Die Etablierung einer rassenunspezifischen, rezessiven Nichtwirts-Resistenz, wie sie für die mlo vermittelte Resistenz beschrieben wurde, stellt hier eine hochwirksame Alternative dar. In dieser Arbeit wurden daher vier bereits charakterisierte RhMLO Gene (RhMLO1 bis RhMLO4), die als Kandidaten für die Vermittlung der Mehltau-Anfälligkeit identifiziert wurden, zunächst mittels RNAi vermittelten Gen-Silencings funktionell untersucht. Durch transiente Agrobacterium-Infiltration von Petalen und anschließender Inokulation konnte für alle vier untersuchten RhMLO Gene ein Effekt auf die Vermittlung der Anfälligkeit gegenüber dem Echten Mehltau nachgewiesen werden. Auch in stabil transgenen Linien konnte dies durch quantitative Inokulationen bestätigt werden. Der stärkste Effekt konnte für RhMLO1, gefolgt von RhMLO2, beobachtet werden. Für RhMLO3 und RhMLO4 konnte in ihrer Kombination nur ein schwacher Effekt nachgewiesen werden. Die RhMLO Gene scheinen in der Vermittlung der Anfälligkeit additiv zu wirken. Diese Ergebnisse reihen sich in die Untersuchungen anderer dikotyler Artenein: Auch in A. thaliana und Tomate wurde das Zusammenspiel mehrerer MLO Gene in der Vermittlung der Anfälligkeit gegenüber dem Erreger des Echten Mehltaus beschrieben. Des Weiteren konnte in diesen Arten auch ein unterschiedlich ausgeprägter Effekt der einzelnen MLO Gene beobachtet werden. Durch Genome Editing Methoden ist es heute möglich, gezielte Mutationen in Genen zu setzen und diese so auszuschalten. Für polyploide und vegetativ vermehrte Arten liegen bislang jedoch nur Studien an Kartoffeln vor. Daher wurde in dieser Arbeit die Anwendbarkeit von TALENs und CRISPR/Cas zur gezielten Mutagenese der RhMLO Gene in der Rosa hybrida Sorte 'Pariser Charme' untersucht. Durch Amplifikation der Bindestellen und Auftrennung auf Polyacrylamid-Gelen konnten Insertionen und Deletionen bis auf eine Base genau detektiert werden. Alle stabil transgenen Linien wiesen ein Mosaikmuster an InDels auf und keine vollständige Mutation der RhMLO Allele konnte festgestellt werden. Durch eine kaskadenartige Vermehrung von In-vitro-Sprossen konnte der Anteil an mutierten Sequenzen innerhalb weniger Multiplikationsschritte zum Teil auf bis zu 90 % gesteigert werden. Mittels Hochdurchsatz-Sequenzierung von Amplikons konntedie Abwesenheit von off-target Effekten bestätigt sowie die erzielten Mutationen eingehend analysiert werden. Die vorliegende Arbeit liefert somit wichtige Erkenntnisse und methodische Ansätze für die Erzeugung mehltauresistenter, nicht transgener Rosensorten.

AB - Die Rose ist eine der beliebtesten und die ökonomisch bedeutendste Zierpflanze weltweit. Die Produktion von Schnittrosen im Gewächshaus begünstigt die Infektion mit dem Erregr des Echten Mehltaus Podosphaera pannosa (Wallr.: Fr.) de Bary, welche nur durch den wiederholten Einsatz von Fungiziden effektiv bekämpft werden kann. Aufgrund der komplexen Genetik der Rose und der starken Rassenbildung des Pathogens ist die Etablierung von monogenen oder polygenen Resistenzen in Sorten besonders aufwendig und in der Regel nur von begrenzter Wirksamkeit. Die Etablierung einer rassenunspezifischen, rezessiven Nichtwirts-Resistenz, wie sie für die mlo vermittelte Resistenz beschrieben wurde, stellt hier eine hochwirksame Alternative dar. In dieser Arbeit wurden daher vier bereits charakterisierte RhMLO Gene (RhMLO1 bis RhMLO4), die als Kandidaten für die Vermittlung der Mehltau-Anfälligkeit identifiziert wurden, zunächst mittels RNAi vermittelten Gen-Silencings funktionell untersucht. Durch transiente Agrobacterium-Infiltration von Petalen und anschließender Inokulation konnte für alle vier untersuchten RhMLO Gene ein Effekt auf die Vermittlung der Anfälligkeit gegenüber dem Echten Mehltau nachgewiesen werden. Auch in stabil transgenen Linien konnte dies durch quantitative Inokulationen bestätigt werden. Der stärkste Effekt konnte für RhMLO1, gefolgt von RhMLO2, beobachtet werden. Für RhMLO3 und RhMLO4 konnte in ihrer Kombination nur ein schwacher Effekt nachgewiesen werden. Die RhMLO Gene scheinen in der Vermittlung der Anfälligkeit additiv zu wirken. Diese Ergebnisse reihen sich in die Untersuchungen anderer dikotyler Artenein: Auch in A. thaliana und Tomate wurde das Zusammenspiel mehrerer MLO Gene in der Vermittlung der Anfälligkeit gegenüber dem Erreger des Echten Mehltaus beschrieben. Des Weiteren konnte in diesen Arten auch ein unterschiedlich ausgeprägter Effekt der einzelnen MLO Gene beobachtet werden. Durch Genome Editing Methoden ist es heute möglich, gezielte Mutationen in Genen zu setzen und diese so auszuschalten. Für polyploide und vegetativ vermehrte Arten liegen bislang jedoch nur Studien an Kartoffeln vor. Daher wurde in dieser Arbeit die Anwendbarkeit von TALENs und CRISPR/Cas zur gezielten Mutagenese der RhMLO Gene in der Rosa hybrida Sorte 'Pariser Charme' untersucht. Durch Amplifikation der Bindestellen und Auftrennung auf Polyacrylamid-Gelen konnten Insertionen und Deletionen bis auf eine Base genau detektiert werden. Alle stabil transgenen Linien wiesen ein Mosaikmuster an InDels auf und keine vollständige Mutation der RhMLO Allele konnte festgestellt werden. Durch eine kaskadenartige Vermehrung von In-vitro-Sprossen konnte der Anteil an mutierten Sequenzen innerhalb weniger Multiplikationsschritte zum Teil auf bis zu 90 % gesteigert werden. Mittels Hochdurchsatz-Sequenzierung von Amplikons konntedie Abwesenheit von off-target Effekten bestätigt sowie die erzielten Mutationen eingehend analysiert werden. Die vorliegende Arbeit liefert somit wichtige Erkenntnisse und methodische Ansätze für die Erzeugung mehltauresistenter, nicht transgener Rosensorten.

U2 - 10.15488/3465

DO - 10.15488/3465

M3 - Dissertation

CY - Hannover

ER -