TY - BOOK

T1 - Molekularbiologische und physiologische Untersuchung von Connexin-Halbkanälen in Atemwegsepithelzellen nach Adenosinrezeptorstimulierung

AU - Dierks, Anne

PY - 2023

Y1 - 2023

N2 - Sowohl die Freisetzung von Adenosin als auch die Aktivität von Connexin-Halbkanälen werden mit pathologischen Ereignissen in der Lunge, wie Entzündun-gen, in Verbindung gebracht. Die humane Calu-3-Zelllinie wurde als Modell für das Epithel der Atemwege verwendet, um das Zusammenspiel zwischen Connexin-Halbkanälen und Adenosinrezeptorsignalwegen in Epithelzellen der Atemwege zu untersuchen. Die Genexpression von Connexin-Isoformen auf mRNA- und Protein-ebene wurde mittels quantitativer real time PCR, Western Blotting und Immunfär-betechniken analysiert. Der Beitrag spezifischer Connexin-Isoformen zur Bildung von Halbkanälen wurde durch short interfering RNA-vermittelte Connexin-spezifische Knockdowns und anschließende Farbstoffaufnahmeexperimente be-stimmt. 5'-N-Ethylcarboxamidoadenosin (NECA) ein Adenosinrezeptor-Agonist, sowie pharmakologische Inhibitoren spezifischer Adenosinrezeptor-Subtypen und intrazellulärer Adenosinrezeptor-Signalmoleküle, wurden verwendet, um die Rolle des Adenosinrezeptorsignalweges zur Regulierung der Connexin-Halbkanalaktivität zu klären. NECA steigerte die Connexin 26-Halbkanalaktivität in Calu-3-Zellen über die Stimulierung des A2B Adenosinrezeptor. Diese Hochregulierung erfolgte durch die Aktivierung der Proteinkinase A und des Transkriptionsfaktors spezifi-sches Protein 1, was zu einer erhöhten Proteinproduktion von Connexin 26 führte. Zudem wurden zwei neue polyphenolische Verbindungen, CVB2-61 und CVB4-57, als Connexin-Halbkanalblocker getestet. Beide Verbindungen blockierten die Farbstoffaufnahme in Neuro2a-Zellen, die humanes Connexin 26 oder Connexin 46 exprimierten. Dass CVB2-61 und CVB4 57 die Farbstoffaufnahme in Connexin 26-exprimierenden Zellen bei einer Konzentration von 5 µM hemmten, während bei Zellen, die Connexin 46 exprimieren, 20 µM hemmten, ließ auf eine Spezifität für Connexin 26-Halbkanäle schließen. CVB2 61 oder CVB4-57 in einer Konzentrati-on von 5 µM unterdrückten die Farbstoffaufnahme in NECA-behandelten Calu-3-Zellen. Dieses Ergebnis bestätigt, dass die Farbstoffaufnahme und ihre Verstärkung durch den Adenosinrezeptorsignalweg in Calu-3-Zellen auf Connexin 26 zurückzu-führen ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der A2B Adeno-sinrezeptor die Connexin 26-Halbkanalaktivität verstärkt und dass die neuen poly-phenolischen Connexin-Halbkanalblocker CVB2-61 und CVB4-57 diesen Effekt unterdrücken können, was auf einen möglichen therapeutischen Nutzen der Verbin-dungen für Connexin 26-Halbkanal-abhängige Pathologien hindeutet.

AB - Sowohl die Freisetzung von Adenosin als auch die Aktivität von Connexin-Halbkanälen werden mit pathologischen Ereignissen in der Lunge, wie Entzündun-gen, in Verbindung gebracht. Die humane Calu-3-Zelllinie wurde als Modell für das Epithel der Atemwege verwendet, um das Zusammenspiel zwischen Connexin-Halbkanälen und Adenosinrezeptorsignalwegen in Epithelzellen der Atemwege zu untersuchen. Die Genexpression von Connexin-Isoformen auf mRNA- und Protein-ebene wurde mittels quantitativer real time PCR, Western Blotting und Immunfär-betechniken analysiert. Der Beitrag spezifischer Connexin-Isoformen zur Bildung von Halbkanälen wurde durch short interfering RNA-vermittelte Connexin-spezifische Knockdowns und anschließende Farbstoffaufnahmeexperimente be-stimmt. 5'-N-Ethylcarboxamidoadenosin (NECA) ein Adenosinrezeptor-Agonist, sowie pharmakologische Inhibitoren spezifischer Adenosinrezeptor-Subtypen und intrazellulärer Adenosinrezeptor-Signalmoleküle, wurden verwendet, um die Rolle des Adenosinrezeptorsignalweges zur Regulierung der Connexin-Halbkanalaktivität zu klären. NECA steigerte die Connexin 26-Halbkanalaktivität in Calu-3-Zellen über die Stimulierung des A2B Adenosinrezeptor. Diese Hochregulierung erfolgte durch die Aktivierung der Proteinkinase A und des Transkriptionsfaktors spezifi-sches Protein 1, was zu einer erhöhten Proteinproduktion von Connexin 26 führte. Zudem wurden zwei neue polyphenolische Verbindungen, CVB2-61 und CVB4-57, als Connexin-Halbkanalblocker getestet. Beide Verbindungen blockierten die Farbstoffaufnahme in Neuro2a-Zellen, die humanes Connexin 26 oder Connexin 46 exprimierten. Dass CVB2-61 und CVB4 57 die Farbstoffaufnahme in Connexin 26-exprimierenden Zellen bei einer Konzentration von 5 µM hemmten, während bei Zellen, die Connexin 46 exprimieren, 20 µM hemmten, ließ auf eine Spezifität für Connexin 26-Halbkanäle schließen. CVB2 61 oder CVB4-57 in einer Konzentrati-on von 5 µM unterdrückten die Farbstoffaufnahme in NECA-behandelten Calu-3-Zellen. Dieses Ergebnis bestätigt, dass die Farbstoffaufnahme und ihre Verstärkung durch den Adenosinrezeptorsignalweg in Calu-3-Zellen auf Connexin 26 zurückzu-führen ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der A2B Adeno-sinrezeptor die Connexin 26-Halbkanalaktivität verstärkt und dass die neuen poly-phenolischen Connexin-Halbkanalblocker CVB2-61 und CVB4-57 diesen Effekt unterdrücken können, was auf einen möglichen therapeutischen Nutzen der Verbin-dungen für Connexin 26-Halbkanal-abhängige Pathologien hindeutet.

U2 - 10.15488/14451

DO - 10.15488/14451

M3 - Dissertation

CY - Hannover

ER -