TY - BOOK

T1 - Gezielte Mutagenese mit Cas-Endonukleasen zur Etablierung von Bymovirus-Resistenzen in Gerste

AU - Hoffie, Robert Eric

N1 - Dissertation

PY - 2023

Y1 - 2023

N2 - Seit der neolithischen Revolution haben Domestikation und Pflanzenzüchtung die vom Menschen angebauten Pflanzen grundlegend verändert - aus Wildpflanzen wurden Kulturpflanzen. Insbesondere ab dem 19. Jahrhundert intensivierten die ersten Pflanzenzüchterinnen und -züchter ihre Arbeit zur Verbesserung von Kulturpflanzen. Mit der aufkommenden wissenschaftlichen Disziplin der Genetik wuchs das Verständnis dafür, wie Eigenschaften vererbt und verändert werden. Die moderne Genomik mit der Sequenzierung von Pangenomen und leistungsfähiger Bioinformatik trägt wesentlich dazu bei, die genetischen Grundlagen dieser Eigenschaften und die Bedeutung genetischer Veränderungen immer besser zu verstehen. Mit der Genomeditierung steht heute ein Methodenset zur Verfügung, um Gene von Kulturpflanzen gezielt zu verändern, sowohl für die wissenschaftliche Untersuchung von Genfunktionen als auch für die züchterische Verbesserung von Pflanzen. Insbesondere die vom mikrobiellen Immunsystem CRISPR-Cas abgeleiteten Cas-Endonukleasen haben sich dabei als nützliches und praktikables Werkzeug erwiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde die CRISPR-assoziierte Endonuklease Cas9 zur gezielten Mutagenese zweier bekannter Anfälligkeitsgene der Gerste gegen die Gelbmosaikvirose eingesetzt. Die Gelbmosaikvirose ist eine der bedeutendsten Krankheiten der Gerste (Hordeum vulgare L.) in Europa und Asien. Sie wird von den beiden Bymoviren Gerstengelbmosaikvirus (Barley Yellow Mosaic Virus, BaYMV) und Mildes Gerstenmosaikvirus (Barley Mild Mosaic Virus, BaMMV) verursacht. Mit Eukaryotic Translation Initiation Factor 4E (EIF4E) und Protein Disulfide Isomerase-Like 5-1 (PDIL5-1) sind zwei Anfälligkeitsgene der Gerste bekannt, für die resistenzvermittelnde Allele beschrieben wurden. Derzeit sind fast alle Wintergerstensorten in Europa resistent gegen BaYMV und BaMMV, jedoch basieren diese Resistenzen fast ausschließlich auf den EIF4E-Allelen rym4 und rym5. Doch diese Resistenzen wurden bereits von angepassten Virusstämmen gebrochen, sodass ein Bedarf an neuen Resistenzvarianten und -mechanismen besteht. Ziel dieser Arbeit war es daher, neue resistenzvermittelnde Allele von EIF4E zu generieren sowie die in Gerstenlandrassen beschriebenen, resistenzvermittelnden Allele von PDIL5-1 in anfälligen Genotypen zur reproduzieren. Dafür wurden beide Gene mittels Cas9 gezielt mutiert, wobei erfolgreich verschiedene Knockout- und Basenmutationen in PDIL5-1 sowie Knockout-Mutationen in EIF4E induziert werden konnten. Die Nachkommenschaften der Primärmutanten wurden manuell mit BaMMV infiziert und sowohl die Knockout-Mutationen in EIF4E und PDIL5-1 als auch die Basensubstitutionen in PDIL5-1 führten zur Resistenz gegen das Virus. Im Gegensatz zu PDIL5-1 ging der Knockout von EIF4E jedoch mit einer Reduktion des Kornertrags einher. Aus diesem Grund wurde für dieses Kandidatengen zusätzlich die Baseneditierung in Wintergerste etabliert. Mihilfe von Cas9-Derivaten, die gezielt C-zu-T- und A-zu-G-Basen-substitutionen induzieren, wurden so insgesamt zehn neue Allele von EIF4E erzeugt, die in nachfolgenden Arbeiten auf ihre resistenzvermittelnden Eigenschaften überprüft werden können. Die vorliegende Arbeit liefert konkrete Beispiele dafür, wie mithilfe der Genomeditierung Pflanzenforschung und -züchtung, insbesondere im Hinblick auf Krankheitsresistenzen, verbessert werden können. Mit den Methoden der gezielten Mutagenese ist es möglich, Genvarianten für vorteilhafte Eigenschaften, die in der Kulturpflanzenvielfalt (z.B. in Genbanken) mithilfe der Hochdurchsatzsequenzierung und modernen Methoden der Genetik immer schneller gefunden werden, für die Pflanzenzüchtung nutzbar zu machen. Damit kann ein wesentlicher Beitrag für eine nachhaltigere Landwirtschaft geleistet werden.

AB - Seit der neolithischen Revolution haben Domestikation und Pflanzenzüchtung die vom Menschen angebauten Pflanzen grundlegend verändert - aus Wildpflanzen wurden Kulturpflanzen. Insbesondere ab dem 19. Jahrhundert intensivierten die ersten Pflanzenzüchterinnen und -züchter ihre Arbeit zur Verbesserung von Kulturpflanzen. Mit der aufkommenden wissenschaftlichen Disziplin der Genetik wuchs das Verständnis dafür, wie Eigenschaften vererbt und verändert werden. Die moderne Genomik mit der Sequenzierung von Pangenomen und leistungsfähiger Bioinformatik trägt wesentlich dazu bei, die genetischen Grundlagen dieser Eigenschaften und die Bedeutung genetischer Veränderungen immer besser zu verstehen. Mit der Genomeditierung steht heute ein Methodenset zur Verfügung, um Gene von Kulturpflanzen gezielt zu verändern, sowohl für die wissenschaftliche Untersuchung von Genfunktionen als auch für die züchterische Verbesserung von Pflanzen. Insbesondere die vom mikrobiellen Immunsystem CRISPR-Cas abgeleiteten Cas-Endonukleasen haben sich dabei als nützliches und praktikables Werkzeug erwiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde die CRISPR-assoziierte Endonuklease Cas9 zur gezielten Mutagenese zweier bekannter Anfälligkeitsgene der Gerste gegen die Gelbmosaikvirose eingesetzt. Die Gelbmosaikvirose ist eine der bedeutendsten Krankheiten der Gerste (Hordeum vulgare L.) in Europa und Asien. Sie wird von den beiden Bymoviren Gerstengelbmosaikvirus (Barley Yellow Mosaic Virus, BaYMV) und Mildes Gerstenmosaikvirus (Barley Mild Mosaic Virus, BaMMV) verursacht. Mit Eukaryotic Translation Initiation Factor 4E (EIF4E) und Protein Disulfide Isomerase-Like 5-1 (PDIL5-1) sind zwei Anfälligkeitsgene der Gerste bekannt, für die resistenzvermittelnde Allele beschrieben wurden. Derzeit sind fast alle Wintergerstensorten in Europa resistent gegen BaYMV und BaMMV, jedoch basieren diese Resistenzen fast ausschließlich auf den EIF4E-Allelen rym4 und rym5. Doch diese Resistenzen wurden bereits von angepassten Virusstämmen gebrochen, sodass ein Bedarf an neuen Resistenzvarianten und -mechanismen besteht. Ziel dieser Arbeit war es daher, neue resistenzvermittelnde Allele von EIF4E zu generieren sowie die in Gerstenlandrassen beschriebenen, resistenzvermittelnden Allele von PDIL5-1 in anfälligen Genotypen zur reproduzieren. Dafür wurden beide Gene mittels Cas9 gezielt mutiert, wobei erfolgreich verschiedene Knockout- und Basenmutationen in PDIL5-1 sowie Knockout-Mutationen in EIF4E induziert werden konnten. Die Nachkommenschaften der Primärmutanten wurden manuell mit BaMMV infiziert und sowohl die Knockout-Mutationen in EIF4E und PDIL5-1 als auch die Basensubstitutionen in PDIL5-1 führten zur Resistenz gegen das Virus. Im Gegensatz zu PDIL5-1 ging der Knockout von EIF4E jedoch mit einer Reduktion des Kornertrags einher. Aus diesem Grund wurde für dieses Kandidatengen zusätzlich die Baseneditierung in Wintergerste etabliert. Mihilfe von Cas9-Derivaten, die gezielt C-zu-T- und A-zu-G-Basen-substitutionen induzieren, wurden so insgesamt zehn neue Allele von EIF4E erzeugt, die in nachfolgenden Arbeiten auf ihre resistenzvermittelnden Eigenschaften überprüft werden können. Die vorliegende Arbeit liefert konkrete Beispiele dafür, wie mithilfe der Genomeditierung Pflanzenforschung und -züchtung, insbesondere im Hinblick auf Krankheitsresistenzen, verbessert werden können. Mit den Methoden der gezielten Mutagenese ist es möglich, Genvarianten für vorteilhafte Eigenschaften, die in der Kulturpflanzenvielfalt (z.B. in Genbanken) mithilfe der Hochdurchsatzsequenzierung und modernen Methoden der Genetik immer schneller gefunden werden, für die Pflanzenzüchtung nutzbar zu machen. Damit kann ein wesentlicher Beitrag für eine nachhaltigere Landwirtschaft geleistet werden.

U2 - 10.15488/13247

DO - 10.15488/13247

M3 - Dissertation

CY - Hannover

ER -