TY - BOOK

T1 - Entwicklung eines Prozesses zur Herstellung rekombinanter virusähnlicher Partikel als Vakzinkandidat gegen das Denguefieber

AU - Hirsch, Janet

PY - 2019

Y1 - 2019

N2 - Die Bekämpfung des Denguefiebers stellt eine globale Herausforderung dar, denn nahezu die Hälfte der Weltbevölkerung ist von einer Infektion bedroht und die Infektionsrate steigt kontinuierlich. Es handelt sich um eine virale Infektionskrankheit, die starke Schmerzen verursacht und tödlich verlaufen kann. Die Herausforderung bei der Entwicklung eines Vakzins gegen das Denguefieber wird maßgeblich durch die Koexistenz von vier Serotypen des Erregervirus verursacht, welche alle gleichzeitig abgedeckt werden müssen. Das vorgestellte Projekt zur Entwicklung eines Vakzinkandidaten sieht die Kombination verschiedener Hüllproteine des Denguevirus in virusähnlichen Partikeln (VLPs) vor. Ein Hüllprotein des Denguevirus Serotyp 1 wurde in Escherichia coli exprimiert und akkumulierte in Form von Inclusion Bodys (IBs). Nach dem Ultraschallaufschluss der Zellen wurden die IBs abzentrifugiert und mit Guanidin solubilisiert. Die chromatographische Feinreinigung erfolgte mit einer Ni2+-NTA-Säule, von der das Produkt mit einer Reinheit von 90-99 % eluierte. Während der nachfolgenden Dialyse renaturierte das Protein und bildete selbstanordnend VLPs. Ihr Durchmesser folgte einer Verteilung, deren Mittelwert von den Renaturierungs-bedingungen abhängig war. In Carbonatpuffer bei pH 10 wurden sowohl mit dem Rasterkraft-mikroskop als auch mit dem Fluoreszenzmikroskop sphärische Partikel mit einem mittleren Durchmesser von 50 nm beobachtet. Die VLPs ähnelten somit dem Denguevirus, welches ebenfalls 50 nm misst, sie induzierten jedoch kaum neutralisierende Antikörper und erzielten daher nicht die nötige immunologische Funktion. Bei der Lagerung über einen Monat erwiesen sich VLPs in Carbonatpuffer als stabil, während solche in Ammoniakpuffer zeitabhängig aggregierten. L-Arginin wirkte in diesem Zusammen-hang aggregationsverzögernd. Bei Erhitzung aggregierten VLPs in Carbonatpuffer bei 50-55 °C und wiesen somit eine mit dem Denguevirus vergleichbare Stabilität auf. Ein zweites Zielprotein mit geringfügig abweichender Sequenz konnte nicht mit demselben Verfahren hergestellt werden, vermutlich aufgrund molekularbiologischer Eigenschaften des Stammes. Um die Teilnahme zweier Hüllproteine am selben VLP (Bivalenz) nachzuweisen, wurde ein fluoreszenzmikroskopisches Verfahren entwickelt, mit dem bisher jedoch keine bivalenten VLPs detektiert werden konnten. Die Herstellung weiterer viraler Hüllproteine und deren Kombination in VLPs sind Gegenstand aktueller Forschung. Mit dieser Arbeit wurde ein Beitrag zur Entwicklung eines Impfstoffkandidaten und somit zum globalen Kampf gegen das Denguefieber geleistet.

AB - Die Bekämpfung des Denguefiebers stellt eine globale Herausforderung dar, denn nahezu die Hälfte der Weltbevölkerung ist von einer Infektion bedroht und die Infektionsrate steigt kontinuierlich. Es handelt sich um eine virale Infektionskrankheit, die starke Schmerzen verursacht und tödlich verlaufen kann. Die Herausforderung bei der Entwicklung eines Vakzins gegen das Denguefieber wird maßgeblich durch die Koexistenz von vier Serotypen des Erregervirus verursacht, welche alle gleichzeitig abgedeckt werden müssen. Das vorgestellte Projekt zur Entwicklung eines Vakzinkandidaten sieht die Kombination verschiedener Hüllproteine des Denguevirus in virusähnlichen Partikeln (VLPs) vor. Ein Hüllprotein des Denguevirus Serotyp 1 wurde in Escherichia coli exprimiert und akkumulierte in Form von Inclusion Bodys (IBs). Nach dem Ultraschallaufschluss der Zellen wurden die IBs abzentrifugiert und mit Guanidin solubilisiert. Die chromatographische Feinreinigung erfolgte mit einer Ni2+-NTA-Säule, von der das Produkt mit einer Reinheit von 90-99 % eluierte. Während der nachfolgenden Dialyse renaturierte das Protein und bildete selbstanordnend VLPs. Ihr Durchmesser folgte einer Verteilung, deren Mittelwert von den Renaturierungs-bedingungen abhängig war. In Carbonatpuffer bei pH 10 wurden sowohl mit dem Rasterkraft-mikroskop als auch mit dem Fluoreszenzmikroskop sphärische Partikel mit einem mittleren Durchmesser von 50 nm beobachtet. Die VLPs ähnelten somit dem Denguevirus, welches ebenfalls 50 nm misst, sie induzierten jedoch kaum neutralisierende Antikörper und erzielten daher nicht die nötige immunologische Funktion. Bei der Lagerung über einen Monat erwiesen sich VLPs in Carbonatpuffer als stabil, während solche in Ammoniakpuffer zeitabhängig aggregierten. L-Arginin wirkte in diesem Zusammen-hang aggregationsverzögernd. Bei Erhitzung aggregierten VLPs in Carbonatpuffer bei 50-55 °C und wiesen somit eine mit dem Denguevirus vergleichbare Stabilität auf. Ein zweites Zielprotein mit geringfügig abweichender Sequenz konnte nicht mit demselben Verfahren hergestellt werden, vermutlich aufgrund molekularbiologischer Eigenschaften des Stammes. Um die Teilnahme zweier Hüllproteine am selben VLP (Bivalenz) nachzuweisen, wurde ein fluoreszenzmikroskopisches Verfahren entwickelt, mit dem bisher jedoch keine bivalenten VLPs detektiert werden konnten. Die Herstellung weiterer viraler Hüllproteine und deren Kombination in VLPs sind Gegenstand aktueller Forschung. Mit dieser Arbeit wurde ein Beitrag zur Entwicklung eines Impfstoffkandidaten und somit zum globalen Kampf gegen das Denguefieber geleistet.

U2 - 10.15488/5586

DO - 10.15488/5586

M3 - Dissertation

CY - Hannover

ER -