TY - BOOK

T1 - Bioprozessentwicklung zur enzymatischen Herstellung von (-)-Patchoulol und strukturverwandten Produkten

AU - Ekramzadeh, Kimia

N1 - Dissertation

PY - 2020

Y1 - 2020

N2 - Patchouliöl ist ein Gemisch aus Sesquiterpenen und Sesquiterpenoiden mit olfaktorischen sowie pharmakologischen Eigenschaften und wird von der Patchoulipflanze produziert. Die konventionelle Gewinnung aus Pflanzenmaterial ist mit ökologischen und ökonomischen Hindernissen verbunden. Methoden der Biotechnologie bieten alternative Möglichkeiten zur Herstellung des für die Industrie wichtigen essentiellen Öls sowie zur Erhöhung des Anteils der duftgebenden Komponente (-)-Patchoulol. In der vorliegenden Arbeit wurde die mikrobielle in vitro und in vivo Produktion von Patchouliöl untersucht und optimiert. Im ersten Teil der Dissertation wurde das in Vorarbeiten entwickelte biotechnologische Verfahren zur in vitro Produktion von Patchouliöl über die Multiprodukt-Patchoulolsynthase optimiert. Das Enzym konnte erfolgreich über eine Tandem-Two-Step-Chromatographiemethode mittels Affinitäts- und Größenausschlusschromatographie mit einer Reinheit von 96 % isoliert werden. Im Vergleich zur Strategie aus Vorarbeiten wurde die Bioaktivität um das Dreifache erhöht. Anhand kinetischer Untersuchungen wurden die Reaktionsbedingungen der in vitro Bioka-talyse mittels der isolierten Patchoulolsynthase im Hinblick auf eine ideale Produktzusammensetzung optimiert. Es wurden Einflussfaktoren, die zur Veränderung der Enzymstruktur und der Produktselektivität der Multiprodukt-Sesquiterpensynthase führen, untersucht. Sowohl durch Veränderung der Reaktionsparameter (Temperatur, pH-Wert) als auch des Reaktionsmediums konnte die Reaktionskaskade in der aktiven Tasche beeinflusst und die Produktzusammensetzung verändert werden. Die Substratflexibilität der vielseitigen Patchoulolsynthase wurde über die Biokonversion sechs nicht natürlicher Substrate evaluiert. Es konnten neue, mit Heteroatomen modifizierte, lineare und makrozyklische Kohlenstoffgerüste produziert werden. Abschließend war es in einer Ganzzellbiokatalyse möglich, den E. coli-eigenen Mevalonat-unabhängigen Stoffwechselweg über Metabolic Engineering so zu modifizieren, dass sowohl die Codon-optimierte Patchoulolsynthase, als auch der natürliche Sesquiterpenvorläufer E,E-Farnesylpyrophosphat exprimiert wurden. Nach Analyse der Fermentationsbedingungen wie pH-Wert, Temperatur, IPTG-Konzentration, Medienzusammensetzung und verwendeter Stamm wurde die in situ Produktgewinnung optimiert. Mit dem polymeren Adsorber Diaion® HP 20 wurde die höchste (-)-Patchoulolkonzentration gewonnen. Der optimierte Bioprozess wurde auf den Maßstab von 2 L-Bioreaktoren skaliert. In einer fed-batch-Kultivierung konnte das (-)-Patchoulol mit einer Konzentration von 18,9 mg·L-1 und einer Produktivität von 7,2 mg·L-1·d-1 erhalten werden.

AB - Patchouliöl ist ein Gemisch aus Sesquiterpenen und Sesquiterpenoiden mit olfaktorischen sowie pharmakologischen Eigenschaften und wird von der Patchoulipflanze produziert. Die konventionelle Gewinnung aus Pflanzenmaterial ist mit ökologischen und ökonomischen Hindernissen verbunden. Methoden der Biotechnologie bieten alternative Möglichkeiten zur Herstellung des für die Industrie wichtigen essentiellen Öls sowie zur Erhöhung des Anteils der duftgebenden Komponente (-)-Patchoulol. In der vorliegenden Arbeit wurde die mikrobielle in vitro und in vivo Produktion von Patchouliöl untersucht und optimiert. Im ersten Teil der Dissertation wurde das in Vorarbeiten entwickelte biotechnologische Verfahren zur in vitro Produktion von Patchouliöl über die Multiprodukt-Patchoulolsynthase optimiert. Das Enzym konnte erfolgreich über eine Tandem-Two-Step-Chromatographiemethode mittels Affinitäts- und Größenausschlusschromatographie mit einer Reinheit von 96 % isoliert werden. Im Vergleich zur Strategie aus Vorarbeiten wurde die Bioaktivität um das Dreifache erhöht. Anhand kinetischer Untersuchungen wurden die Reaktionsbedingungen der in vitro Bioka-talyse mittels der isolierten Patchoulolsynthase im Hinblick auf eine ideale Produktzusammensetzung optimiert. Es wurden Einflussfaktoren, die zur Veränderung der Enzymstruktur und der Produktselektivität der Multiprodukt-Sesquiterpensynthase führen, untersucht. Sowohl durch Veränderung der Reaktionsparameter (Temperatur, pH-Wert) als auch des Reaktionsmediums konnte die Reaktionskaskade in der aktiven Tasche beeinflusst und die Produktzusammensetzung verändert werden. Die Substratflexibilität der vielseitigen Patchoulolsynthase wurde über die Biokonversion sechs nicht natürlicher Substrate evaluiert. Es konnten neue, mit Heteroatomen modifizierte, lineare und makrozyklische Kohlenstoffgerüste produziert werden. Abschließend war es in einer Ganzzellbiokatalyse möglich, den E. coli-eigenen Mevalonat-unabhängigen Stoffwechselweg über Metabolic Engineering so zu modifizieren, dass sowohl die Codon-optimierte Patchoulolsynthase, als auch der natürliche Sesquiterpenvorläufer E,E-Farnesylpyrophosphat exprimiert wurden. Nach Analyse der Fermentationsbedingungen wie pH-Wert, Temperatur, IPTG-Konzentration, Medienzusammensetzung und verwendeter Stamm wurde die in situ Produktgewinnung optimiert. Mit dem polymeren Adsorber Diaion® HP 20 wurde die höchste (-)-Patchoulolkonzentration gewonnen. Der optimierte Bioprozess wurde auf den Maßstab von 2 L-Bioreaktoren skaliert. In einer fed-batch-Kultivierung konnte das (-)-Patchoulol mit einer Konzentration von 18,9 mg·L-1 und einer Produktivität von 7,2 mg·L-1·d-1 erhalten werden.

U2 - 10.15488/10195

DO - 10.15488/10195

M3 - Dissertation

CY - Hannover

ER -